Life Med|脂質納米顆粒靶向遞送mRNA研發(fā)策略

湃客：Life Medicine 2022-06-28 07:06

針對近幾年席卷全球的新型冠狀病毒（COVID-19），疫苗研發(fā)一直是布局重點和焦點，被寄予厚望。其中，BNT162b（商品名Comirnaty）和mRNA-1273（商品名Spikevax）兩款mRNA納米疫苗以其極高的保護效率和研發(fā)速度聞名于世，并迅速引發(fā)國內外廣泛關注。目前，以mRNA疫苗為研究熱點的核酸疫苗被視為是繼（減毒）滅活疫苗、亞單位疫苗之后的第三代新型疫苗，正在引領疫苗研發(fā)的潮流，相關產(chǎn)業(yè)也正如火如荼的進行中。“新冠”mRNA疫苗的成功同時推動了全球范圍內mRNA的產(chǎn)業(yè)化進程。 這些事件的背后實際上是mRNA分子優(yōu)化、體內遞送等底層相關技術取得的長足進展，特別是在脂質納米顆粒（LNPs）遞送平臺的突破。一般認為，LNPs是遞送mRNA最好的選擇之一，若要擴寬mRNA的應用場景，研發(fā)靶向遞送LNPs技術至關重要。

底層技術的發(fā)展加速mRNA應用

自20世紀60年代mRNA被發(fā)現(xiàn)以來，有關mRNA的應用探索就一刻也不曾停止。mRNA分子具有不穩(wěn)定性、免疫原性、無法高效進入細胞等特點，在實際應用中非常受限。隨著mRNA分子優(yōu)化技術、遞送技術平臺的不斷發(fā)展，這些缺點正在慢慢地被克服。

其一，mRNA分子優(yōu)化平臺，包括有：1）序列優(yōu)化的進展，如5，3端非翻譯區(qū)序列的篩選、多聚腺嘌呤（poly A）尾巴的長度優(yōu)化、開放閱讀框（ORF）密碼子的優(yōu)選等；2）核苷酸化學修飾的引入，如5-甲基尿苷和N1-甲基假尿苷的使用不僅能降低mRNA的免疫原性，還能提高其穩(wěn)定性；3）制備工藝的提升，如體外轉錄（IVT）放大工藝的成熟、加帽工序的簡化、純化和質檢方法的穩(wěn)定等。其二，遞送載體平臺，尤其是LNPs遞送技術的相對成熟。一般來講，LNPs由四種成分組成，每種成分都扮演著相對重要的角色：可電離陽離子脂質被認為是LNPs中最重要的成分，它直接決定了mRNA的包裹效率和遞送效率；中性輔助磷脂（如DSPC、DOPE）和膽固醇脂質有助于提升LNPs的穩(wěn)定性以及轉染效率；聚乙二醇脂（PEG-Lipid）在調節(jié)LNPs尺寸、穩(wěn)定性、半衰期、遞送效率等方面的作用也十分明顯。值得指出的是，LNPs中單一成分并非獨自行使功能，各組分之間的配比在mRNA的實際應用中非常重要。

通過多手段研發(fā)技術，目前LNPs-mRNA已被應用到多個領域，包括疫苗研發(fā)、針對多種重大疾病的蛋白替代療法、基因編輯療法、細胞療法等方面。 

LNPs靶向遞送策略擴寬mRNA應用場景

mRNA精準遞送是保證治療效果的必要條件之一。針對體表的組織器官（如肌肉、眼等）可通過局部給藥方式實現(xiàn)，而體內更深層次器官的遞送則選擇靜脈注射更為合適。靜脈給藥后LNPs介導的肝臟靶向較容易實現(xiàn)，如何實現(xiàn)肝外的選擇性遞送則具有挑戰(zhàn)。針對此科學問題，研究人員嘗試了多種策略，取得了不錯進展。本亮點文章重點總結了近期發(fā)表的幾類mRNA靶向遞送策略。

（一）靶向分子修飾

在LNPs表面進行靶向分子修飾是實現(xiàn)細胞靶向遞送最直接的方法。Jonathan A. Epstein教授團隊最近利用CD5抗體修飾包裹了CAR mRNA的LNPs，可提高其體內靶向T淋巴細胞的能力。將上述mRNA制劑靜脈注射到心衰小鼠模型后，可在體內對T細胞進行重編程，使其形成有功能的CAR-T細胞，可以靶向過度活躍的心臟成纖維細胞，有效降低了心臟纖維化，并幫助小鼠恢復了心臟功能。Dan Peer教授團隊通過重組融合蛋白（MadCAM-1-D1D2-Fc）修飾LNPs技術，將mRNA選擇性遞送到特定白細胞亞群，在結腸炎小鼠模型中展現(xiàn)出了潛在的治療前景。不同于抗體修飾，Gabriel A. Kwong課題組最近開發(fā)了一種光控的多肽配體置換平臺，可快速變換修飾到LNPs表面的靶向抗原多肽，在體內實現(xiàn)對多種抗原特異性T細胞群的靶向mRNA遞送。以上修飾技術可顯著增強對特定細胞類型的靶向遞送能力，但在特異性方面略顯不足。

（二）高通量篩選

上文提到，可離子化陽離子脂質是LNPs中最重要的成分。通過結構各異的化學結構庫進行高通量篩選早已被證實是研發(fā)靶向LNPs最為有效的方法之一，目前大多數(shù)LNPs是由此技術研發(fā)產(chǎn)生的，可實現(xiàn)肝、肺、脾、腦等器官的mRNA遞送,但此方法相對盲目、工作量大。James Dahlman課題組結合“DNA條形碼”和深度測序技術，開發(fā)了一種新型的高通量篩選技術，簡稱為FIND，可顯著提升LNPs的篩選效率。他們將Cre mRNA和特定序列的DNA條形碼包裹到同一個LNPs中，只需設計不同的DNA條形碼就可制備出帶有特定“標簽”的一系列LNPs-mRNA藥物。將這些“標簽”各異的LNPs通過靜脈一起注射到Cre誘導表達tdTom的轉基因小鼠中，利用流式細胞儀檢測tdTom陽性細胞，并結合DNA深度測序的方法可鑒別出特定細胞靶向的LNPs載體。通過該體系，他們可同步篩選超200種LNPs，顯著提高了LNPs的篩選效率。

（三）可預測性LNPs優(yōu)化

區(qū)別于高通量篩選，如果給出明確的LNPs設計原則，則會大大縮短研發(fā)周期，提高研發(fā)效率。Daniel Siegwart課題組2020年在Nature Nanotechnology上報道了一種可預測性設計的LNPs研發(fā)技術，命名為SORT。在原有4組分LNPs基礎上，僅添加一種帶有不同電荷的新脂質分子（SORT分子），則可實現(xiàn)mRNA在小鼠的肝臟、脾臟、肺部的靶向遞送和基因編輯。通過增加陽離子脂質能夠使mRNA特異遞送進入肺部；陰離子脂質能夠使mRNA特異進入脾臟；而可離子化陽離子脂質則會增強肝臟的靶向遞送。重要的是，SORT技術具有普適性，可在多種類型的LNPs基礎上快速研發(fā)出肝外器官靶向LNPs。進一步機制探究發(fā)現(xiàn)，SORT分子可調控SORT-LNPs在器官水平的生物分布、LNPs自身pka、及表面血清蛋白冠等，這些因素最終決定了LNPs在體內的靶向遞送能力。文中指出，在器官靶向遞送方面，LNPs表面的血清蛋白冠起到最關鍵作用，識別這些獨特的蛋白質可能會在未來研發(fā)靶向其他器官的LNPs方面有所幫助。

圖1. 體內靶向遞送mRNA-LNPs的研發(fā)策略。

總結與展望
器官選擇性遞送對于拓寬mRNA臨床應用至關重要。本文提到的幾種代表性策略在一定程度上提出了解決方案，但各有不足之處。如何開發(fā)出靶向其他重要器官（如心臟、胰腺、腎臟）的LNPs、如何實現(xiàn)對特定臟器中特定細胞類型的靶向遞送都是未來需要解決的重要問題。隨著研究人員對mRNA靶向遞送技術的深入研究，相信未來會有更多的靶向遞送策略研發(fā)出來用于精準醫(yī)療研究。

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原文鏈接：https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnac004